该试剂盒包含两种试剂:试剂 1. 终止酶促反应的 AMP 产生并同时除去 ATP,将 AMP 转换成 ADP;试剂 2. 将 ADP 转换成 ATP, ATP 参与萤光素/ 萤光素酶反应产生发光信号。该试剂盒还适用于检测不使用 ATP 作为底物的生化反应,如 cAMP- 依赖性磷酸二酯酶(PDE)和细菌的 DNA 连接酶。AMP-Glo™ 检测试剂盒具有很宽的动态范围,在低底物转化情况下仍产生很强的信号,使得它非常适合于筛选低活性酶。该试剂盒产生的假阳性率最低,Z` 值大于 0.7。
特点 - 优点
• 底物转换率很低的情况下仍可获得高信号强度:测量的酶活性,更接近生理条件,非常适合于低活性的 酶。
• 灵敏,对极低浓度的 AMP 也具敏感性:节省成本,相比其他试剂盒,消耗更少的酶。
• 通用:可检测几乎任何 AMP 生成酶,仅用单一平台即可以筛选更广泛的酶。
• 在很宽范围的起始底物浓度下,精确测量 AMP 水平:真实反映酶活性,非常适合测量抑制剂对酶活性的影响。
• 发光法读数:相比基于荧光的方法,较不易受化合物库干扰。
应用
• 通过对目标酶作用效果的检测筛选文库化合物
• 适用酶类范围广泛:
- 泛素连接酶
- cAMP 特异的磷酸二酯酶
- 氨酰基-tRNA 合成酶
- DNA 连接酶
- poly(A)脱腺苷化酶
- 脱甲基酶(间接方法)
注意事项
AMP-Glo™ 检测试剂盒提供足够的试剂以进行说明书中指定数量的小量体积——384 孔板检测(5μl 反应酶:5μl AMP-Glo™ I Reagent:10μl AMP Detection Solution)。该系统还可用于标准的 96 孔板反应(前述溶液比例为:25μl : 25μl : 50μl)。
Figure 1. AMP-Glo™ Assay principle.
The AMP-Glo™ Assay can be used to detect activity of enzymes that catalyze any reaction that produces AMP as a reaction product, including enzymes that do not use ATP as a substrate (e.g., cAMP-specific PDE, poly(A) deadenylases, ribonucleases, bacterial DNA ligase) as well as enzymes that use ATP as a substrate (e.g., ubiquitin ligase, aminoacyl tRNA synthetase, eukaryotic DNA ligase, succinyl CoA synthetase). After completing the enzymatic reaction, adding AMP-Glo™ Reagent I terminates the reaction, removes any remaining ATP, and converts AMP to ADP. Adding AMP Detection Solution drives the conversion of ADP to ATP and the detection of ATP through the luciferase reaction. The amount of AMP produced by the reaction is proportional to the light measured and can be extrapolated using a standard curve.