[创新技巧]如何利用CRISPR改造植物基因组

[创新技巧]如何利用CRISPR改造植物基因组

如今，CRISPR技术已经用于许多植物基因组的改造，包括著名的模式生物，如拟南芥和蒺藜苜蓿，以及重要的经济作物，如马铃薯、玉米、小麦、水稻和蘑菇等。尽管CRISPR系统在大多数物种中都通用，但涉及到植物细胞的编辑，还是不能一成不变。

Addgene的Joel McDade在此介绍了植物基因组的改造，突出了CRISPR系统针对植物的特定改变，并概括了科研人员的植物基因组编辑工具。

CRISPR的各个组分

总的来说，之前的实验设计规则也适用于植物的基因编辑。不过，常用的CRISPR质粒可能需要做一些改变，才能在植物细胞中起作用。与其他模式系统一样，Cas9或Cas9变异体和单链向导RNA（gRNA）的表达就足以修饰植物的基因组。

与其他生物一样，gRNA也是由~20个核苷酸的靶向序列和~75个核苷酸的支架序列组成，不过驱动gRNA表达的启动子则取决于所使用的细胞类型。在植物细胞中，gRNA的表达可通过植物特异的RNA pol III启动子来驱动，如AtU6、TaU6、OsU6或OsU3。Addgene提供了30多种不含gRNA的骨架，方便你插入靶向序列，最快构建好载体。

目前，研究人员已经对一些Cas9变异体进行密码子优化，以加强在植物细胞中的翻译。同时，他们也使用缺乏核酸酶活性的Cas9激活物（如dCas9-VP64）或阻遏物（dCas9-KRAB 或dCas9-SRDX）来激活或抑制植物细胞中的目标基因。

Cas9表达通常是由植物来源的RNA pol II启动子驱动的。举个例子，常用的RNA pol II启动子包括花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV 35S）或泛素启动子。Addgene也提供了含有Cas9的质粒，可用于目标基因的敲除、激活和抑制。之前提到的许多不含gRNA的骨架也包含Cas9，可同时表达Cas9和gRNA。

将这些组分导入植物细胞

一旦万事俱备，下一步就是将CRISPR组分导入细胞了。记住，这些组分的高效导入对任何实验而言都是至关重要的，若gRNA或Cas9表达失败，结果肯定不乐观。CRISPR组分可瞬时表达，也可稳定表达，这取决于导入方法和细胞类型。

你可以选择用PEG（聚乙二醇）来导入CRISPR组分并瞬时表达，但这种方法仅限于原生质体细胞，也就是细胞壁被去除的植物细胞。你也可以选择农杆菌介导的导入，它利用农杆菌作为载体，将你感兴趣的基因导入目的细胞。Johannes Stuttmann实验室提供了pDGE Dicot Genome Editing Kit，包含了各种带有Cas9且与农杆菌兼容的载体。

对于植物的基因组改造，尽管许多细节不同，如启动子、蛋白序列或转染方法，但基本原理还是与其他系统无异。目前已经有很多文献发表，也有很多工具出现，因此你完全不必担心。大胆地去试试吧。